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    猪肺炎支原体膜蛋白的电泳分析及免疫印迹检测

    [导读]以 猪肺 炎支原 体 z 株为试验材料 , 采用 ssD一PA GE 和 westm 印迹对该菌膜蛋 白进行了分析。

    猪肺炎支 原体是猪喘气病 ( 猪地 方流 行性肺炎 ) 的病 原。 该菌是一种介于细 菌和病毒之间的最简单 的 自行复制 的原核微生物。 由猪肺炎支原体诱发引起的猪喘气病为慢性的、 死亡率低而发病率高的传染病, 流行范 围广, 而且难以治 愈, 严重危害着 养猪业的发展。 自从发现病 愈猪能获 得 坚强 的免疫力后, 人们即开始了致 病机理及免疫的研究ce ayr 等曾证明猪肺 炎支原体的致病 因子位 于细胞膜上, 而不在细胞质, 并进一步证实细胞膜蛋 白是导致猪患 支原体肺炎 的主要 因。 因此, 应用分子生物学技术对其抗原蛋 白的研究受 到了人们的重视

    本研究以猪肺炎 支原体Z 株为 试验材 料, 采用 SD SPA GE和 W esentr印迹 法对该菌膜蛋 白进行 了分析, 并深入研究其抗原性、 免疫特性, 为探索猪喘气病防治新途径提供依据

    1 材料与方法

    1.1 材料

    菌种: 猪肺炎支原体 Z 株, 由中国兽药监察 所提供培养基: A26 液体培养基 ( 含 50 % 水 解 乳蛋 白 H an ks 液,20 % 犊牛血清,30 % 牛心 消化汤等,p H 7.6 的液体培养基 )低分子量 标准蛋 白质, 上海 东风生 化试剂厂产 品。 内含:磷酸化酶 b, 相对 分子质量 9.4K l 了 ; 牛 血清白蛋 白, 相对分子 质量 6.7x104 ; 肌动蛋 白, 相 对分子质量 4.3xl护 ; 碳酸醉, 相对分子质量 3.0xlo月 ; T Mv 外壳蛋 白, 相 对分 子质量l·7 5 火 一04 。羊抗兔 I四 酶标抗体: 购 自军事 医学科学 院微生物 流行病研究所S BL 一 0 型超速冷冻 离心 机,D YYnI 型电泳 仪及 转移 电泳仪等

    1.2 猪肺 炎支原体的培养、 收集及 膜的制备猪肺 炎支原体 Z 菌株按 1:10 接种量 加入 培 养基 中,37 ℃培养并传代。 在 一定数量 时 (p H 降至 6.8 时 ) 15 0 0 r/ m in离心 20 m in, 收获菌体细胞, 并用 p H 7.2 的 BPS 洗 涤 3 次,在 0.25 moF L NaC I 溶液中悬浮。 然后 取悬浮 液, 采用 低渗 超声法破膜 [4 ],30 。以〕 r/ m in 离』心 3 0 m in 收 集沉淀, 即 为膜制。 将其悬浮于 1:20 的 p一 缓冲液中 ( 肠w 巧 法测蛋 白含量约 8m 酬m )L, 一 2 0 ℃保存备用。 菌体细胞 与膜 制剂 均采用负染法在电子显微镜下 检测免疫血 清制备 与 的纯化 3 g G2 取体重 左 右的健康雄性 白兔 k g( 购 自山西 省生物 制品厂 ), 注射乳 化的完全弗氏佐剂抗 原 1 次, 此后分 3 次 注射不完全弗 氏佐剂抗原。 在 4 次免疫结束后, 静脉采血, 琼脂糖双扩散法测抗血 清效 价达 1: 犯 以上, 即心脏 采血 提 取抗 血 清抗血清按周顺伍等 〔’ 〕 的方法分离纯化 坛G, 冻 干保存

    1.4 S D SP A G E 分 离猪肺炎 支原体 膜蛋白采用垂直 板 型 不连 续 凝胶 电泳 系 统, 分 离 胶 为 12.5 %,浓缩胶为 5 % 制 板。 膜制剂样 品和标准蛋 白样品分 别与 Zx 样品溶解液等量 混合, 沸水浴 3 m in 后, 按每孔 20协L 量 加入电泳处于浓缩胶段时, 电压 为 10V, 进 人分离胶段 时, 调 电压 150 V, 待指示染料迁移距下沿约 11.5c m 时, 停止 电泳取部分进行考马斯亮蓝 2R 50 染色 检测, 其余未染 色凝胶 准备转移

    1.5 转移 电泳将裁好的 NC膜 与 未染 色 的凝 胶一 起 浸泡 于 转移 缓 冲 液, 浸湿后, 装 配 成“ 凝 胶 三 明治” , 插 人 电泳转移 槽NC膜接正极, 凝胶接负极, 连接 电泳仪, 电压 50V, 转移 过夜转移完毕, 取出膜, 切下标准蛋 白条带, 氨基黑 orB 染色, 脱色液脱色。 凝胶 置考 马斯亮 蓝 2R 50 染色 液染 色, 然 后脱 色,检测转移是 否完全

    1.6 Westen印迹将转移 电泳 后 的 N C 膜 置 竹B s( 含 0.05 % westen-20的irTs 一NaCl液,p H 7.5 ) 中, 每次 5 m in, 洗 3 次。 置封闭液 内,于空气浴振荡器中,37 ℃ 保温 l h, 竹B S 再洗 3 次。 加入1:20一1:6 0 稀释 的一抗 ( 纯化 的 I gG,0.30.5mg/m L ) 及对照阴性 血清,37 ℃ 保温 l h, 取 出TTB S 洗 3 次。 再加入1:2 0一 1:300稀 释 的 羊 抗 兔 I g G 酶标抗 体,37 ℃ 保温 l h, 取 出TTS 洗 3 次。 最后加人底 物溶液, 暗处反应 3 m in, 蒸馏 水洗涤终止反应, 避光晾干、 拍照

    2.2 We s tenr 印迹结果样 品经免疫印迹检测发 现, 在 36 种膜蛋 白 ( 或多 肤 ) 中检测 出 6 种蛋 白具有免 疫原性。 相对 分子 质量分 别为 54 04 05 2 16 04 6 7 1 04 2 7 6 03 6 63 03 3 5 4 0, 即 5P 45P 24P74P 33P7、 刃4。 其中 5P 45P 24P7 和 3P 4 染 色较 深,4P 3和 3P 7 则相对 较弱。 结果见 图 2P 3 7 —P 34 —图 2 猪肺炎支原体膜蛋白的免疫印迹结果

    2 结 果

    2.1 S D SP A G E 结果

    猪肺炎支原体膜蛋 白经 S DSP A G E 分 离后, 电泳 图谱上呈现约 36 条带, 相 对分 子 质 量 范 围在 1.18/ 1了9.12/ 104,电泳 图谱见 图 1

    2.2 We s tenr 印迹结果样 品经免疫印迹检测发 现, 在 36 种膜蛋 白 ( 或多 肤 ) 中检测 出 6 种蛋 白具有免 疫原性。 相对 分子 质量分 别为 54 04 05 2 16 04 6 7  04 2 7 6 03 6 63 03 3 5 4 0, 即 5P 45P 24P74P 33P7、 刃4。 其中 5P 45P 24P7 和 3P 4 染 色较 深,4P 3和 3P 7 则相对 较弱。 结果见 图 2

    3 讨论

    3.1 猪肺炎支原体膜蛋 白的 电泳 分离分析sD SP AG E 分 析微生物蛋 白质结构 组成 是 目前 最常用 方法之一eGayr 通过 13 % s D SPAG E 测得 猪肺炎支原体膜蛋 白相对分子 质量 范围为 1.5x 104 一9.25xor`, 用 10 % 凝胶 电泳分离猪肺炎 支 原 体 V P lP l 膜 制 剂 得 到 23 条 带。 本 试 验 采用12.5 % 凝 胶,s Ds以 G E 所测得猪肺炎 支原 体 z 株膜 蛋 白的相对分子质量 范围与 Ge卿 的结果基本相 符, 但蛋 白条带数 明显比该文献报道 的要 多。 我们分析认为可能是膜蛋 白提 取方法不同所致eGayr 采用 的是反 复冻 融法 制备膜蛋 白, 而本 试验 采用 的是低渗超声 法。 此 条件 比较剧 烈, 再通过 SD S 作用, 会产生一些更加小 的多肤 分子, 从电泳 图谱上也可看 到, 出现 了许多不太清晰 的低分子量蛋 白条带。 本试验所采用 的各条件 是`我们通过反复实践摸索得 出的。 低 渗超声法破膜较彻底, 膜制剂收获率高; 膜蛋 白采用 12.5 % 的凝胶 电泳分离效果较 为理, 条带清晰, 重复性好, 有利 于抗原 蛋 白的检测

    3.2 猪肺炎支原体膜蛋 白的免疫印迹检测租inke rt [6 ] 曾对 猪肺 炎支原 体 A T e e z 7 7 19 克隆 产生 的融合蛋 白进行了抗原 性研究, 发 现 种O、 巧85P 0、 玛0 和 凡6 这5 种蛋 白具有 免疫原 性。 该文 献 报道将 融合 蛋 白通过 aLe m 耐i法电泳分离, 然后 用 oTw ibn 法 进行 免疫 印迹, 检 测 到 的 5 种蛋白为 l 个克隆表达的融合蛋 白。 但 由于融合蛋 白的不稳 定性以 及在免疫印迹过程 中的变性作用 阻碍了其余克隆表达 的融合蛋白的抗原检测, 因此不能确定这 5 种蛋 白就是猪肺炎支原体的全 部抗 原蛋 白w ise 等 [,] 用 rT i otxn1 14 提取了猪肺炎 支原体 JA CTC 2 5 934 膜 中蛋 白, 经 SD SP A G E 分 离、 修饰 的 hTw b in法检测抗 原蛋 白, 结果表明 7P 06P 55P 0 和 4P 4 这 4 种蛋 白具有抗原性, 并 且证明这 4 种蛋 白为膜中完整蛋 白。 本试验对猪肺 炎支 原体膜 制剂的分析得到 了 36 条蛋 白带, 可以 认 为 基本包括 了猪肺炎支原体的全部膜蛋 白 ( 或亚 基 )。 在 免疫 印迹检测 到的 6 种抗原蛋白 中, 其 中有 4 种蛋 白 ( 5P 45P 2P4 7和 玛4) 的酶染 色带颜色较深, 可说明其免疫 原性较 强。 但本试验没有对这些抗原蛋 白的致病性及 是否可诱导机体产生保护性免疫等问题作更深人 的研究, 有待于进一步的探讨

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